ایرانی با سابقه سقط راجعه خودبه خودی

Transcript

1 مقاله پژوهشی اصیل پلی مورفیسم 14+ bp/-14 bp ژن HLA-G در میان زنان ایرانی با سابقه سقط راجعه خودبه خودی 4 بهار پاکنهاد 1 گیتا سعادت نیا *2 سینا میرزا احمدی 3 پیروز صالحیان SJM 17 student-1 Mscst دانشجوي کارشناسی ارشد زیست شناسی دانشگاه آزاد اسالمی واحد اهر ایران. - 2 PhD دكتري بيولوژي مولكولي استاديار پژوهشكده زيست فناوري سازمان پژوهش هاي علمي و صنعتي ايران تهران ایران. 3- PhD دكتري ژنتیک مولکولی استاديار دانشكده علوم پايه دانشگاه آزاد اسالمی زنجان ایران. 4- MD پاتولوژيست تهران ایران. چكيده زمینه و هدف: آنتی ژن لوکوسیتی انساني HLA-G یک مولکول غیر کالسیک از HLA های کالس I است که بر خالف HLA کالسیک دارای میزان پلیمورفیسم پائینی است. تصور می شود که اين مولكول دارای نقش میانجیگری در ارتباط بین مادر و جنین باشد. اين تحقیق با هدف بررسی ارتباط بین پلی مورفیسم اضافه شدگی / حذف 14 جفت بازی در اگزون 8 ژن HLA-G و بیماری سقط های مکرر خودبهخودی (RSA) انجام پذيرفت. مواد و روش ها: در اين مطالعه نمونه DNA از 50 فرد بیمار مبتال به سقط مکرر خودبهخودی و 50 فرد با باروری طبیعی تهیه شد. اگزون 8 ژن HLA-G درهر دو گروه بيمار و كنترل توسط واکنش زنجیره ای پلی مراز تکثیر شد و بوسیله الکتروفورز ژل آکریل آمید مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. يافتهها: مشاهده شد که 60 % افراد مبتال به سقط های مکرر خودبهخودی دارای ژنوتیپ هموزیگوت + 14bpو يا 14bp- بودند درحاليكه در گروه کنترل فقط % 34 افراد ژنوتیپ هموزیگوت را نشان دادند. این تفاوت از لحاظ آماری معنادار بود )0/034=P( نسبت شانس یا odd's Ratio در مقایسه هموزیگوت به نسبت هتروزیگوت در این مطالعه 2/91 بود. نتیجه گیری: آنالیز آماری اين تحقيق نشان داد كه بين گروه بيمار و كنترل از نظر هتروزیگوت و هموزیگوت بودن افراد تفاوت معناداری وجود دارد. الزم است که مطالعات بیشتری با استفاده از تعداد نمونه های بیشتر و از قومیت های نژادی مختلف کشور جهت بررسی این ارتباط به عنوان یک عامل مستعد کننده RSA انجام گیرد. کلیدواژهها: پلی مورفیسم 14bp/-14bp+ ژن HLA-G سقط مکرر خودبهخودی. نویسنده مسئول پست الكترونيك gitasaadat@irost.ir * تاریخ دریافت: ۱۳۹۳/5/6 تاریخ پذیرش: ۱۳۹۳/10/10 SJM, Vol 4, No 14 & 15, Spring & Summer 2015

2 پلی مورفیسم... گیتا سعادت نيا و همکاران مقدمه سقط خود به خودی یکی از شايعترين عوارض بارداري است. سقط خود به خودی به عنوان 3 يا بيش از 3 مورد ختم حاملگي خود به خودی قبل از هفته 20 يا حتي 28 حاملگي تعریف شده است )1(. علل سقط راجعه خود به خودی مولتي فاكتوريال است ولي مي توان آن ها را به دو دسته عمده جنيني و مادري تقسيم كرد. در مورد علل مادري سقط راجعه مي توان به اختالالت انعقادي اختالالت غدد درون ريز و نقص هاي اندومتريال اشاره كرد )2, 3(. عوامل ايمونولوژيك نيز از دیگر عوامل مهم در اين خصوص هستند. در كل در حدود نيمي از موارد سقط راجعه غيرقابل توجيه بوده و كه نقش علل ايمونولوژيك در اين بين بيش از ساير علل مطرح است. )4(. آنتی ژن لوکوسیتی انسانی HLA-G یک مولکول غیر کالسیک از HLA های کالس I است که بر خالف HLA کالسیک دارای میزان پلی مورفیسم کمی است. یکی از پلی مورفیسم های شناخته شده در این ژن پلی مورفیسم 14bp در اگزون شماره 8 است که با پایداری mrna ژن HLA-G و با الگوی پردازش متفاوت آن ارتباط دارد که در نتیجه میزان بیان و عملکرد HLA-G را در دوران بارداری تحت تاثیر قرار می دهد. مولکول HLA-G در ابتدا بر روی سلول های تروفوبالست تهاجمی مشاهده شد و تصور می شود که نقش میانجیگری در ارتباط مادر و جنین دارد )4(. HLA-G برای گیرنده های سلولی (natural killer) NK يک لیگاند است و این توانایی را دارد که از فعالیت سلول های NK جلوگیری نماید که اگر این فعالیت محدود نشود به طور بالقوه می تواند به جنین آسیب وارد شود )5(. پروموتر HLA-G به شدت با خطر سقط خود به خودی در ارتباط است عدم تعادل در پروموتور از این رابطه علت و معلولی ممانعت بعمل می آورد )6(. HLA-G یک سرکوب کننده بسیار قوی سیستم ایمنی است و در مدوالسیون سیستم ایمنی مادر در دوران بارداری و در نتیجه پذیرش جنین نیمه آلوژن توسط مادر بسیار مهم به نظر می رسد )4, 8(. 7, مطالعات بر روی پلی مورفیسم HLA-G در بیماران مبتال به سقط خود به خودی در جوامع مختلف قومی گزارش شده است )4, 10-8(. با این حال نتیجه گیری در مورد ارتباط پلی مورفیسم HLA-G با بارداری پاتولوژیک بحث انگیز باقی مانده است )10, 11(. پیشنهاد شده است که پلی مورفیسم درج / حذف 14 جفت بازی در منطقه ترجمه نشده ' 3 ژن HLA-G در اگزون شماره 8 رونویسی این ژن را تحت تاثیر قرار می دهد. مطالعات نشان می دهد درج 14bp در این ژن در ارتباط است با با سطوح پایین HLA-G محلول در ارتباط است و این خطر سقط خود به خودي را افزایش می دهد. برخی از مطالعات نشان داده اند که زنان هموزیگوت درج 14 جفت باز دارای افزایش خطر ابتال به سقط بوده اند و سطح HLA-G محلول پالسما این افراد به طور معناداری کمتر از افراد هتروزیگوت یا فاقد 14 جفت باز بوده است )14-11(. اين تحقیق با هدف بررسی ارتباط بین پلی مورفیسم اضافه شدگی/ حذف 14 جفت باز در منطقه ترجمه نشده ' 3 اگزون شماره 8 ژن HLA-G با بیماری سقط مکرر خود به خودی (RSA) انجام پذيرفت. مواد و روش ها اين مطالعه از نوع مورد-شاهدي بوده و بر روي زنان ايراني مراجعه كننده به کلینیک سقط مکرر بيمارستان فوق تخصصي صارم در 6 ماهه دوم سال 91 صورت پذيرفته است. در اين مطالعه از 50 زن مبتال به سقط مکرر خود به خودی که نتایج بررسی کاریوتیپ شرایط هیستروسکوپی مقادیر هورمونی عفونت ها و انعقاد خون آنان نرمال بوده و 50 زن با سابقه بارداری نرمال با حداقل 2 فرزند نمونه خون تهيه شد. از زنان شرکت کننده در این مطالعه رضایت نامه آگاهانه مطابق با کدهای اخالق پزشکی اخذ شده است. استخراج :DNA جهت استخراج DNA از نمونه خون افراد از کیت Fer- mentas Genomic DNA Purification (Kit Thermo scientific Cat. (K0512 No: استفاده شد. بطور خالصه 200 میکرولیتر از نمونه خون با 400 میکرولیتر از محلول لیز کننده مخلوط و پس از قراردادن 5 دقیقه در انکوباتور 65 درجه 600 میکرولیتر کلروفرم اضافه شده و به حالت تعلیق درآورده شد سپس نمونه در دور در دقیقه به مدت 2 دقیقه سانتریفوژ شده فاز رويي به یک لوله تازه انتقال داده شده و 800 میکرولیتر از محلول رسوب دهنده اضافه شد و در دمای اتاق به مدت 2-1 دقیقه مخلوط شد. در مرحله بعد نمونه در دور در دقیقه به مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ شده پس از تخليه محلول رویی رسوب DNA در 100 میکرولیتر از محلول NaCl 1/2 M حل شده و با اضافه کردن 300 میکرولیتر اتانول سرد رسوب DNA را 10 دقیقه در 20- C قرار داده سپس 3 تا 4 دقیقه سانتریفیوژ كرده )10000 دور در دقیقه( و DNA خالص را در 100 میکرولیتر از آب بدون نوکلئاز حل كرده و براي انجام PCR مورد استفاده قرار گرفت. 18 SJM دوره ۴ شماره ۱۴ و ۱۵ بهار و تابستان ۱۳۹۴

3 در حاصله نتايج دادند نشان را هموزیگوت ژنوتیپ افراد %36 فقط کنترل واکنش از حاصل نتايج از نمونهاي 1 تصویر است. شده خالصه 1 جدول 1 نمودار و ميدهد نشان را مورفيسم پلي تعيين جهت از پليمر زنجيرهاي ميدهد. نشان را مطالعه مورد جمعیت در آمده بدست های ژنوتیپ مقایسه کمتر 0/05 از که آمد بدست 0/034 مطالعه اين براي χ 2 آزمون نتیجه شانس نسبت است. معنادار آماری نظر از که است تفاوتی از حاکی و بوده این در هتروزیگوت به هموزیگوت مقایسه این در odd's Ratio یا است. 2/91 مطالعه GE14 پرايمرهاي: HLAG از استفاده با پليمراز: اي زنجيره واكنش RHG4: و 5 -GTGATGGGCTGTTTAAAGTGTCACC-3 )16,15,11( 5 -GGAAGGAATGCAGTTCAGCATGA-3 هر شد. گرفته نظر در لیتر میکرو 50 نهايي حجم در PCR واكنش 25 μl میزان به Master Mix 2x ( Fermentas, Cat. شامل نمونه مقطر آب و پرايمر هر از 10 pmol و الگو No:K0171) DNA 1 μg دستگاه در PCR فرايند بود. لیتر میکرو 50 حجم تا استريل تقطير دوبار درجه 95 در دقيقهاي 3 دناتوراسیون 1 سیکل شروع شامل: ترموسایکلر درجه 94 در دناتوراسیون ثانيه 30 شامل سيكل 30 آن بدنبال سلسيوس نهايت در و درجه 72 در اکستنشن ثانيه 120 درجه 64 در انیلینگ ثانيه 60 محصوالت بررسي براي شد. انجام سلسيوس درجه 72 در دقيقه 10 شد انجام %10 آمید اکریل پلی ژل روی ها نمونه الکتروفورز PCR SJM 19 قرار بررسي مورد Gel Documentation دستگاه از استفاده با ها ژل و bp با برابر نوکلئوتید 14 دارای موارد در یافته تکثیر قطعه اندازه گرفتند. ژل در که بود 210 bp با برابر نوکلئوتید 14 بدون موارد در و 224 )هتروزیگوت( باز دو یا )هموزیگوت( باز تک صورت به یا موارد اکریالمید صورت به بحث مورد نوکلئوتید 14 به مربوط سکانس دهند می نشان را خود.5 -ATTTGTTCATGCCT-3 )14(: است شده گزارش مقاالت در زیر براي و گرديد وارد SPSS آماري افزار نرم در ها داده كليه آماري: آناليز عنوان به >p 0.05 شد. استفاده کای مجذور آزمون از آماري آناليزهاي شد. گرفته نظر در آماري آناليزهاي در معناداری سطح ها يافته کمترین و 40 سن بیشترین و 31/42±4/6 بیماران سنی میانگین 10 بیشترین که داشتند سقط 2/82±1/26 متوسط بطور و بود. سال 22 بود. 13±1/1 افراد این در بلوغ سن متوسط بود. مورد 2 کمترین و مورد وضعیت است. بوده سالگی 10 در آنان کمترین و سالگی بیشترین 16 که درصد 22 و بود طبیعی و منظم درصد 78 بیماران این در ماهانه عادت شده سقط دچار تازگی به یا افراد این اکثر كه داشتند نامنظم ماهانه عادت رابطه این در که شدند. قاعدگی در نظمی بی دچار سقط از پس یا و بودند های سقط بودن خودی به خود مسئله این تا شد مشورت معالج پزشک با های سقط به مبتال افراد %60 که شد مشاهده نکند. نقض را افراد این %24 تعداد اين از كه بودند هموزیگوت ژنوتیپ دارای خودی به خود مکرر گروه در درحاليكه دادند نشان را -14+bp ژنوتيپ %36 و +14+bp ژنوتيپ مرفيسم پلي تعيين جهت پليمراز زنجيرهاي واکنش از حاصل نتايج 1: تصوير HLA-G ژن 8 اگزون +14bp/-14bp +14bp/-14bp هتروزيگوت ستون 2 و 3 : -14bp هموزيگوت 1: ستون SJM, Vol 4, No 14 & 15, Spring & Summer 2015

4 پلی مورفیسم... گیتا سعادت نيا و همکاران بحث تقریبا از هر 300 بارداری یک مورد سقط مکرر اتفاق می افتد پس یکی از شایع ترین عارضه ها در بارداری است. با این که بیش از %80 افراد پس از سقط خود به خودی به طور طبیعی باردار شده و به تولد نوزاد سالم منجرمی شود اما احتمال تکرار سقط %40-%50 است )17(. در ميان داليل سقط مکرر خود به خودی اختالالت ايمنولوژيک با اهميت ترين علت است. از جمله مسائلی که در مورد بارداری موجب بررسی ها و تحقیقات زیادی در دنیا شده است عدم رد جنین بوسیله سیستم ایمنی مادر در بارداری های نرمال است. HLA-G آنتی ژن بافتی است که هم منشا مادری دارد هم جنینی و عموما در سطح سلول های سیتوتروفوبالست که با سلولهای مادری در تماس هستند یافت می شود و در مراحل مختلف تکامل و بقای جنین دخالت دارد. از آنجایی که سلول های تروفوبالست مرز بین جنین و مادر را تشکیل می دهد پس HLA-G می تواند نقش محافظتی در برابر سیستم ایمنی مادر داشته باشد )2, 17(. بیان بسیار باالی HLA-G در سلول های مهاجم تروفوبالست جفت دیده شده است و ممکن است در النه گزینی جنین هم تاثیرگذار باشد. HLA-G با عملکرد متضاد با دستگاه ایمنی می تواند مانع سقط خود به خودی شود.)19,18( جدول 1: فراواني ژنوتیپ های بدست آمده از بررسي پلي مرفيسم 14bp/- HLA-G اگزون 8 ژن +14bp ژنوتیپ کنترل بیمار +14 //////+bp -14 //////+bp /+14 //////+bp 12 7 فراواني %24 %14 درصد نسبي )هموزیگوت( /-14 //////+bp فراواني درصد نسبي 18 %36 10 %20 فراواني درصد نسبي 20 %40 33 %66 فراواني درصد نسبي )هموزیگوت( +14//////+bp/-14//////+bp )هتروزیگوت( جمع 20 SJM نمودار 1: مقایسه ژنوتیپ ها در جمعیت مورد مطالعه جهت تعيين پلي مرفيسم +14bp/-14bp اگزون شماره 8 ژنHLA-G دوره ۴ شماره ۱۴ و ۱۵ بهار و تابستان ۱۳۹۴

5 SJM 21 Hviid در سال 2002 يك بررسی در دانمارک انجام داد که در آن 61 زوج با بیش از 3 بار سقط خودبه خودی با 47 زوج سالم به عنوان کنترل با روش توالی یابی ژنی و RFLP مورد مقایسه قرار گرفتند. از نظر آماری تفاوتی در ژنوتیپ های این ژن در این افراد وجود نداشت ولي پلی مورفیسم حذف 14bp اگزون 8 در بیماران به صورت پراکنده وجود داشت. 15 درصد از بیماران دارای آلل هموزیگوت حذف 14bp بودند در حالی که این پلی مورفیسم در 2 درصد افراد گروه کنترل وجود داشت. پلی مورفیسم 14bp هتروزیگوت در گروه کنترل بیشتر بود. از نظر او شانس موفقیت بارداری در افراد هتروزیگوت نسبت به مادران هموزیگوت بیشتر است. ممکن است افراد هتروزیگوت تنظیم بهتری درغلظت ایزوفرم های mrna و در نتیجه میزان پروتئین ها داشته باشند. در این مطالعه گفته شده غلظت پایین ایزوفرم های محلول موجب نتایج منفی در IVF میشود و نتیجه گرفتند که پلی مورفیسم HLA-G با بارداری پاتولوژیک ارتباط دارد ولی هنوز بحث انگیز باقی مانده است )11(. HLA-G در مقاله دیگری در سال 2004 توضیح داد که Hviid برای گیرندههای سلولی (natural killer) NK یک لیگاند است و این توانایی را دارد که از فعالیت سلولهای NK جلوگیری نماید. اگر این فعالیت محدود نشود به طور بالقوه می تواند به جنین آسیب وارد شود. عالوه براین پلی مرفیسم اضافه شدگی/ حذف شدگی 14bp را مورد بررسی قرار داد. این پلی مورفیسم در لقاح in vitro نیز بررسی شد و 29 زن مبتال به RSA و 93 زن بارور از نظر این ژنوتیپ مقایسه شدند. در نتیجه آن افرادی که در +14bp هموزیگوت بودند به طور معناداری با کاهش باروری و سقط مکرر و در نتیجه درمان ناموفق با روش IVF مواجه بودند. این بررسی نشان می دهد بیان HLA-G یک نقش تنظیم کننده ایمنی در مادر و جنین طی النه گزینی و بارداری دارد )5(. نتایج بدست آمده در این مطالعه تا حدودی مشابه مطالعاتی است که در دانمارک انجام شده که تعداد بیشتری از افراد هتروزیگوت برای پلی مورفیسم 14bp در گروه کنترل وجود داشتند و افزایش خطر RSA را در زنان با پلی مورفیسم اضافه شدگی 14bp به خصوص به صورت هموزیگوت در این افراد نشان می دهند. با این تفاوت که در مطالعه حاضر در گروه بیماران ژنوتیپ -14bp نیز افزایش یافته بود. Pandy در آمریکا سال 2004 پیشنهاد داده است که پلی مورفیسم اضافه شدگی / حذف 14 جفت باز درمنطقه ترجمه نشده '3 ژن HLA-G در اگزون 8 رونویسی این ژن را تحت تاثیر قرار می دهد. مطالعات ایمونوتراپی با استفاده از پروب نشان میدهد اضافه شدگی 14bp در این ژن با سطوح پایین HLA-G محلول در ارتباط است و خطر سقط خودبهخودی را افزایش میدهد. برخی از مطالعات نشان داده اند که زنان هموزیگوت اضافه شدگی 14 جفت باز دارای افزایش خطر ابتال به سقط خودبه خودی بوده اند و سطح HLA-G محلول پالسما این افراد نیز به طور معناداری کمتر از افراد هتروزیگوت یا فاقد 14 جفت باز بوده است )12(. همانطور که ذکر شد پلی مورفیسم 14bp در اگزون 8 با پایداری mrna ژن HLA-G و با الگوی پردازش متفاوت آن ارتباط دارد در نتیجه میزان بیان و عملکرد HLA-G را در دوران بارداری تحت تاثیر قرار می دهد )10, 15(. Tripathi و همکارانش در 2004 سال مطالعهای در هندوستان انجام دادند و در آن از نظر آماری فراوانی ژنوتیپ هتروزیگوت 1-14bp/+14bp در زنان RSA افزایش یافته بود )16(. مطالعه ای در همین زمینه در چین توسط Yan و همکارانش در سال 2006 انجام شده و ژنوتیپ 109 زن بارور به عنوان گروه کنترل و 79 زن با سابقه RSA برای حذف و اضافه شدن 14bp انجام شده که تفاوت معناداری در مقدار فراوانی آلل های اضافه شده یا حذف 14bp بین گروه کنترل و افراد RSA وجود نداشت اما آلل اضافه شدن 14bp در زنان RSA نسبت به گروه کنترل بیشتر دیده شده و افراد بیمار اغلب ژنوتیپ هتروزیگوت -14bp/+14bp داشتند )20(. مطالعه دیگری در چین توسط Xue و همکارانش انجام شد. آنان در 24 فرد RSA و 88 فرد نرمال مشاهده کردند که فراوانی ژنوتیپ هتروزیگوت -14bp/+14bp به طور معناداری در بیماران RSA در مقایسه با افراد نرمال افزایش یافته بود و این نتایج مغایر با نتایج بدست آمده از دانمارک بود )10(. تفاوت های موجود در نتایج می تواند به علت تفاوت های نژادی باشد. همچنین مشاهده شده است که مقدار رونوشت آلل HLA-G با اضافه شدن 14bp به طور معناداری نسبت به مواردی که آلل دارای حذف 14bp است کاهش یافته است. مشاهده شدن آلل با اضافه شدگی 14bp در گروه RSA امکان دارد که با میزان mrna ایزوفرم های HLA-G و یا احتماال با غلظت این پروتئین ارتباط داشته باشد )16(. در هندوستان مطالعه دیگری در سال 2011 ارتباط این پلی مورفیسم را در 143 زوج RSA و 150 زوج به عنوان گروه کنترل مورد بررسي قرار داد ولی هیچ تفاوت معناداری در حذف یا اضافه شدن 14bp یافت نشد. در SJM, Vol 4, No 14 & 15, Spring & Summer 2015

6 References پلی مورفیسم... گیتا سعادت نيا و همکاران حالی که یک افزایش میزان هموزیگوتی در حذف 14bp در زنان مبتال به RSA یافت شد که می تواند باعث افزایش میزان HLA-Gمحلول شود )17(. نتيجه گيری آنالیز آماری اين تحقيق حاکی از معناداری قضاوت بين گروه بيمار و كنترل از نظر هتروزیگوت و هموزیگوت بود همچنین مطالعه نشان داد که و در گروه بيمار افراد هتروزيگوت كمتري وجود دارد هرچند كه براي بيان ارتباط اين پلی مورفیسم با سقط مکرر خودبه خودی بررسی های بیشتری الزم است. تفاوت های موجود در اين نتایج با مطالعات ديگر می تواند به علت تفاوتهای نژادی باشد. سپاسگزاری این مقاله حاصل پایان نامه کارشناسی ارشد دانشگاه آزاد اسالمی واحد اهر است و با استفاده از اعتبارات مرکز تحقیقات سلولی مولکولی و سلولهای بنیادی صارم انجام شده است. 1. Orgad S, Loewenthal R, Gazit E, Sadetzki S, Novikov I, Carp H. The prognostic value of anti-paternal antibodies and leukocyte immunizations on the proportion of live births in couples with consecutive recurrent miscarriages. Human reproduction. 1999;14(12): Aplin J. Maternal influences on placental development. Seminars in cell & developmental biology. 2000;11(2): Li TC, Makris M, Tomsu M, Tuckerman E, Laird S. Recurrent miscarriage: aetiology, management and prognosis. Human reproduction update. 2002;8(5): Laird SM, Tuckerman EM, Cork BA, Linjawi S, Blakemore AI, Li TC. A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage. Human reproduction update. 2003;9(2): Hviid TV, Hylenius S, Lindhard A, Christiansen OB. Association between human leukocyte antigen-g genotype and success of in vitro fertilization and pregnancy outcome. Tissue antigens. 2004;64(1): Choudhury SR, Knapp LA. Human reproductive failure II: immunogenetic and interacting factors. Human reproduction update. 2001;7(2): Takakuwa K, Adachi H, Hataya I, Ishii K, Tamura M, Tanaka K. Molecular genetic studies of HLA-DRB1 alleles in patients with unexplained recurrent abortion in the Japanese population. Human reproduction. 2003;18(4): Hunt JS, Petroff MG, McIntire RH, Ober C. HLA-G and immune tolerance in pregnancy. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 2005;19(7): Pandey MK, Rani R, Agrawal S. An update in recurrent spontaneous abortion. Archives of gynecology and obstetrics. 2005;272(2): Xue S, Yang J, Yao F, Xu L, Fan L. Recurrent spontaneous abortions patients have more -14 bp/+14 bp heterozygotes in the 3'UT region of the HLA-G gene in a Chinese Han population. Tissue antigens. 2007;69 Suppl 1: Hviid TV, Hylenius S, Hoegh AM, Kruse C, Christiansen OB. HLA-G polymorphisms in couples with recurrent spontaneous abortions. Tissue antigens. 2002;60(2): Pandey MK, Thakur S, Agrawal S. Lymphocyte immunotherapy and its probable mechanism in the maintenance of pregnancy in women with recurrent spontaneous abortion. Archives of gynecology and obstetrics. 2004;269(3): Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic acids research. 1988;16(3): SJM دوره ۴ شماره ۱۴ و ۱۵ بهار و تابستان ۱۳۹۴

7 SJM Shankarkumar U, Shankarkumar A, Chedda Z, Ghosh K. Role of 14-bp deletion/insertion polymorphism in exon 8 of the HLA-G gene in recurrent spontaneous abortion patients. Journal of human reproductive sciences. 2011;4(3): Aruna M, Sirisha PV, Andal Bhaskar S, Tarakeswari S, Thangaraj K, Reddy BM. Role of 14-bp insertion/deletion polymorphism in HLA-G among Indian women with recurrent spontaneous abortions. Tissue antigens. 2011;77(2): Tripathi P, Abbas A, Naik S, Agrawal S. Role of 14-bp deletion in the HLA-G gene in the maintenance of pregnancy. Tissue antigens. 2004;64(6): Meka A, Reddy BM. Recurrent Spontaneous Abortions: An Overview of Genetic and Non-Genetic Backgrounds. Int J Hum Genet. 2006;6(2): Le Bouteiller P, Mallet V. HLA-G and pregnancy. Reviews of reproduction. 1997;2(1): Carosella ED, Moreau P, Le Maoult J, Le Discorde M, Dausset J, Rouas-Freiss N. HLA-G molecules: from maternal-fetal tolerance to tissue acceptance. Advances in immunology. 2003;81: Yan WH, Lin A, Chen XJ, Dai MZ, Gan LH, Zhou MY, et al. Association of the maternal 14-bp insertion polymorphism in the HLA-G gene in women with recurrent spontaneous abortions. Tissue antigens. 2006;68(6): SJM, Vol 4, No 14 & 15, Spring & Summer 2015